FIA-MS/MS를 이용한 리소좀축적병(LSD) 선별검사

내분비물질분석센터(ESAC) 전문의 이아람

리소좀축적병의 발병기전과 임상양상

리소좀(lysosome)은 세포질 내에 흩어져 있으며, 세포폐기물을 소화 및 처리하는 강력한 효소를 포함하는 구형의 주머니 모양 소기관입니다. 소화효소가 결핍되면 리소좀은 산물을 분해할 수 없으며, 폐기물이 세포 내에 축적됩니다. 리소좀축적병(lysosomal storage disease, LSD)은 리소좀의 기능에 영향을 미치는 유전성(선천적) 대사 결함으로 초래되는 질환입니다. 여기에는 리소좀 이화작용의 약 70가지 단일유전자 장애로 구성되며 리소좀 내부에 분해되지 않은 기질이 점진적으로 축적되어 세포 기능 장애, 조직 손상 및 사망을 초래하는 것이 특징입니다. 

Ref) Clinica Chimica Acta. 2020 Oct;509:195–209.

Fig. 1. 리소좀축적병의 전형적인 병적 경로의 예시

리소좀축적병(LSD)의 전형적인 병적 경로에서 보듯이(Fig.1), 리소좀산 가수분해효소(lysosomal acid hydrolase) 결핍으로 효소산물을 생성하지 못하고 비정상적 대사산물의 축적을 초래합니다. 대부분의 LSD는 상염색체 열성 형질로 유전되며 리소좀 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이로 인해 발생합니다. 세부 질환별 하나하나 그 자체로는 드물지만 전체적인 발생률은 출생아 5,000명 중 한 명으로 상대적으로는 흔한 질병입니다.

Ref) Cells. 2020 Aug 14;9(8):1902.

Fig. 2. 리소좀(lysosomes) 및 리소좀 관련 소기관(lysosome-related organelles, LROs)의 장애에 따른 LSD 분류

LSD는 리소좀과 리소좀 관련 소기관(LROs)에 축적된 물질의 생화학적 유형에 따라 스핑고리피드증(sphingolipidoses), 점액다당류증(mucopolysaccharidoses), 당단백질증(glycoproteinoses), 지질축적병(lipid storage diseases)으로 나뉘며 또한 통합막단백질환(integral membrane protein disorders), 번역 후 변형결함(post-translational modification defects), 신경세로이드리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 등으로 세분합니다. 

스핑고리피드증에는 비교적 잘 알려진 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher disease), 크라베병(Krabbe disease), 니만-픽병(Niemann-Pick disease) 등이 있고, 점액다당류증에는 헐러증후군(Hurler syndrome)에 해당하는 MPS I형이 있으며, 당원축적병인 폼페병(Pompe disease)도 리소좀축적병(LSD)에 속합니다. 이들 질환의 원인유전자는 Fig. 2에서 질환 뒤 괄호 안에 명기하였습니다. 

Ref) Clinica Chimica Acta. 2020 Oct;509:195–209.

리소좀축적병은 중추신경계, 안면, 심장, 콩팥, 피부, 근육, 관절, 말초신경, 눈, 귀, 혀, 갑상샘, 폐, 위장관, 장기비대, 골수, 뼈 등 모든 신체 계통과 장기를 침범하며, 복잡한 임상 표현형을 나타냅니다(Fig. 3). 

다음은 리소좀축적병(LSD)을 즉시 고려해 보아야 하는 소아 임상양상을 정리한 표입니다(Table 1). 염증이 없는 관절통/뻣뻣함/구축이나 손목굴증후군, 방아쇠손가락, 재발성탈장/중이염, 각막혼탁, 폐쇄성 수면무호흡증, 간비장비대, 단신, 얼굴변형(coarse face) 등이 이에 속합니다.

Table 1. LSD를 즉시 고려해 보아야 하는 소아 임상양상

Ref) J Paediatr Child Health. 2016 Mar;52(3):262-71.

LSD 검사방법

검사원리는 효소가 합성된 특이적인 기질과 반응하여 특정 산물을 만들어 내면, 그 산물을 측정하는 효소활성도를 평가하는 것입니다. 내부 표준물질과 효소 생성산물은 유동주입 탠덤질량분석법(flow injection analysis–tandem mass spectrometry, FIA-MS/MS)으로 측정되며, 다중반응모니터링[multiple reaction monitoring, MRM=선택반응모니터링(selected reaction monitoring, SRM)] 방식을 적용합니다.

A_e (효소활성도)는 측정된 각 산물의 피크 비율과 관련 내부 표준물질 및 알려진 내부 표준물질 농도로부터 계산된 리터(L)당 시간(h)당 마이크로몰(μmol)로 표시됩니다. 공식에 포함되는 변수들에 대해 기술하면, P/IS는 산물 대 내부 표준물질의 강도의 비율이고, [IS]는 분석 내 내부 표준물질의 농도, V는 분석 부피, ti는 소요 배양시간(incubation time)입니다. 공식은 건조혈액여지(dried blood spot, DBS)의 3.2 mm 펀치에 3.1 μL의 혈액이 포함되어 있다고 가정합니다. 상대반응계수(relative response factor, RRF)는 독립적으로 결정되지 않는 한 1.0으로 가정할 수 있는 수치입니다. 원하는 경우 RRF를 사용하여 검사실 내부 또는 검사실 간에 MS/MS 기기를 조정할 수 있습니다.

Ref) PerkinElmer NeoLSD MSMS Kit (6-plex LSD kit) Assay Workflow

Fig. 4. LSD 6항목 검사 방법

기존의 방법이 각각의 well에서 각각 따로 방치(incubation)하여 각각의 효소반응을 진행시킨 후 합쳐서 다음 단계로 진행한 방법이라면, 본 방법은 방치(incubation)시간부터 하나의 well에서 6개의 효소반응을 동시에 진행하는 방법입니다. 기존 방법에 비해 전처리 과정이 간단하여 검사기관 간의 차이를 줄일 수 있는 장점이 있으며, 국가 차원의 대규모 선별검사에 적합한 방법입니다.

Ref) Henry’s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods – 24th edition

Fig. 5. Tandem mass spectroscopic(MS) scan modes 중 selected reaction monitoring mode

탠덤질량분석(Tandem MS 또는 MS/MS)는 임상검사실에서 일상적인 검체의 정량분석을 위해 사용되는 지배적인 MS 기반 기술이 되었습니다. MS/MS의 가장 중요한 특징은 높은 선택성(selectivity)이며 이를 통해 많은 경우, 매우 낮은 농도의 분석물을 측정할 수 있는 능력을 갖습니다. 간섭에 대한 MS/MS의 감수성은 일반적으로 매우 낮으며, 특히 크로마토그래피 분리와 결합된 경우에는 더욱 그렇습니다. 그 이유는 검출된 화합물이 크로마토그래피 머무름시간(chromatographic retention time), 전구체 이온(precursor ion) m/z 및 생성물 이온(product ion) m/z의 세 가지 물리적 특성으로 분리되고 특징지어지기 때문입니다. 높은 특이도(specificity) 및 많은 검체 처리량(high sample throughput)으로 인해 LC-MS/MS 장비는 임상검사실의 일상적 분석에 널리 사용됩니다.

LSD 검사의 선별/진단 알고리즘

Ref) CLSI NBS07-ED1:2017, J Pediatr. 2015;166:172-7

Fig. 6. MSPHL Lysosomal storage disorder pilot/implementation screening algorithm

Abbreviations: MSPHL, Missouri State Public Health Laboratory; NBS, newborn screening.

위의 LSD 선별 알고리즘이 CLSI 가이드라인에 제시되어 있습니다. 선별검사를 시행하여, 참고치 미만의 값을 보이는 경우, 재검을 시행하고, 초검과 재검 값의 평균이 참고치 미만의 값을 보이는 경우, 위험도를 평가하여 고위험군인 경우, 선별검사에 대한 추적검사를 임상과에 요청하고, 임상과에서는 환아와 부모에게 검사결과를 알리고, 확진을 위한 검사를 준비합니다.

LSD 검사의 추적검사 프로토콜(follow-up protocol)입니다. 1차 검사 양성 시, 동일 검체로 재검 후 여전히 양성일 경우, 재채혈 검체로 검사를 실시하여, 양성일 경우 백혈구 효소검사를 실시합니다. 효소검사에서도 양성일 경우는 유전자검사로 확진합니다. 그 외 추가검사로 대사산물(metabolites)을 측정하면 진단에 도움이 될 수도 있습니다.

검사결과를 해석하는데 유의할 사항은 첫째로 LSD에 대한 이형접합성(heterozygosity)의 보인자 상태(carrier status)는 정확하게 검출해 낼 수 없다는 점입니다. 둘째로는 양성 선별검사 결과는 진단을 강력하게 시사하지만, 독립형(stand-alone)인 생화학 또는 분자 검사에 의한 추적검사가 필요합니다. 그리고 경도의 질환이거나 늦게 발병하는 일부 환아는 신생아 기간 동안 충분히 비정상적인 결과를 얻지 못하여 음성인 결과를 초래할 수 있습니다.

리소좀축적병(LSD) 검사의 국내 실태

신생아 혈액여과지에서 선별검사가 가능한 LSD 중 현재 6종[Hurler(Scheie) disease, Pompe disease, Gaucher disease, Fabry disease, Niemann-Pick A/B disease, Krabbe disease]이 2024년부터 급여로 시행되고 있습니다. LSD 전체 유병률은 전인구에서 1/5,000 정도로 추정되고 있으며, 1991년부터 2005년까지 조사한 6종 정부 지원 신생아 선별검사의 총 유병률(1/4,612)에 비교하여도 비슷한 수준으로, 향후 신생아 선천성대사이상 선별검사에서 LSD 선별검사가 차지하는 비중 및 중요성은 지속적으로 커질 것으로 예상됩니다.

GC Labs 검사항목 안내

* 상기 검사정보는 2024년 05월 23일 기준이며, 추후 변경될 수 있으니 최신 정보를 확인하시기 바랍니다(http://www.gclabs.co.kr).

참고문헌

01. Anderson S, Newborn Screening for Lysosomal Storage Disorders. J Pediatr Health Care. (2018) 32, 285-294.

02. Fuller, M., Meikle PJ, and Hopwood JJ. Epidemiology of lysosomal storage diseases: an overview. Oxford: Oxford PharmaGenesis; 2006. Chapter 2.,

03. 이동환. 유전성 대사질환의 신생아 스크리닝. Korean J Pediatr 2006;49:1125-1139.

04. Clinical and Laboratory Standards Institute. Newborn Blood Spot Screening for Pompe Disease by Lysosomal Acid α-Glucosidase Activity Assays: NBS07-ED1. 1st ed. Wayne (PA): Clinical and Laboratory Standards Institute, 2017

05. Tietz Textbook of Laboratory Medicine-7th edition

06. NeoLSD™ MSMS Kit 제품설명서(insert). Revvity. 2023.