Sequencing
어떤 돌연변이가 선별방법에 의해 검출되었다면
그 돌연변이의 위치와 성상을 알기 위해서는 단일 가닥 DNA상의 염기서열을 분석해야한다.
이 방법의 원리는 DNA polymerase가 상보적인 deoxynucleotides (dNTPs)을 결합시킴으로써 염기서열을 복제해 나갈때,
dideoxynucleotides (ddNTP)를 결합시키는 순간마다 반응이 정지되어 짧은 DNA 조각들이 생성되는 것이다.
염기서열을 알고자하는 부위는 벡터를 이용해 만들어진 cloned DNA 조각이 될 수도 있고 PCR 증폭산물을 직접 사용할 수도 있다.
A, T, G, C라고 표기된 4개의 시험관에 각각 ddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP를 dNTPs와 함께 넣은 다음,
분석하고자 하는 DNA 및 그 DNA의 5'에 상보적인 primer와 DNA polymerase를 첨가하여 반응시킨다.
각 시험관마다 해당하는 염기로 끝나는 다양한 크기의 DNA 조각들이 생성되는데, denaturing gel에 4개의 반응을 각 well별로
전기영동하면 ladder 양상으로 나타나면서 염기서열을 분석할 수 있다. 형광물질 표지를 응용한 자동화된 염기서열 분석기를
널리 이용하고 있다.